Анри дьо Тулуз-Лотрек е роден на 24 ноември 1864 г. във замъка Боск в град Алби, Франция. Родителите му са потомци на стари аристократични фамилии. Баща му граф Алфонс дьо Тулуз-Лотрек е известен като ексцентрик интересуващ се единствено от лов. Майка му Аделаид Тапие дьо Селейран е кротка и порядъчна жена. Първите уроци по рисуване Анри получава от чичо си Шарл, любител художник. През 1872 г. постъпва в лицея "Фонтенас". Най-ранните му запазени рисунки са от 1873 г. Анри страда от костно заболяване, чиято същност не е установена със сигурност. На 30 май 1878 г. чупи лявата си бедрена кост при падане. През август 1879 г. чупи и дясната, което го оставя недъгав за цял живот. Болестта и последиците от нея изиграват голяма роля в по-нататъшния му живот и се отразяват в творчеството му. Изпитвайки комплекси заради недоразвитото си тяло и неугледна външност, Лотрек би могъл да се затвори в самоизолация, или да отвърне с предизвикателство на презрително-снизходителното отношение на околните. Той избира второто.
Неговото скандално поведение и начин на живот стават прословути и са обект на множество анекдоти. В 1881 г. завършва успешно лицея. Същата година взема решение да се отдаде изцяло на живописта. През 1882 г. постъпва като ученик в ателието на официалния художник Леон Бона. На следващата година се мести в ателието на Фернан Кормон. От 1884 г. се установява в бохемския парижки квартал Монмартър. Става редовен посетител на известните развлекателни заведения "Елизе Монмартр", "Мулен дьо ла Галет" и "Ша Ноар". Сприятелява се с артиста и съдържател на кабаре "Мирлитон" Аристид Бриан. Поддържа интимна връзка с известния модел на художници Сюзан Валодон. Сюжети на творбите му стават кабаретата, техните постоянни посетители и артистите. Любими персонажи за него са танцьорите Ла Гулю (Лакомницата) и Валантен Безкостния.
Увлечен от бохемския живот рядко посещава ателието на Кормон. Тук през 1886 г. Тулуз-Лотрек се запознава и сприятелява с Винсент ван Гог. Получава издръжка от семейството си, благодарение на която успява да си устрои ателие. В 1888 г. участва в изложбата на "Двадесетте" в Брюксел. Същата година прекъсва връзката си със Сюзан Валодон. Открива, че е болен от сифилис. През 1889 г. се запознава с Едгар Дега от чието творчество се възхищава. Става редовен посетител на новооткритото кабаре "Мулен Руж". На следващата година участва за втори път в изложбата на "Двадесетте". Тук между него и художникът Анри де Гру става спречкване. Гру не е съгласен с участието на картини на Ван Гог в изложбата. Тулуз-Лотрек яростно защитава приятеля си. Двамата опоненти си обявяват дуел, който не се осъществява. От 1891 г. Тулуз-Лотрек започва да става популярен с плакатите си за "Мулен Руж" и други увеселителни заведения, както и за Аристид Брюан. Започва да се занимава с литография.
През 1893 г. прави две изложби при галериста Морис Жоаян. Създава плакати за танцьорката Жана Аврил и певицата Ивет Гилбер. Все по-често посещава публични домове. През 1894 се настанява да живее в новооткрития публичен дом на улица "Мулен" в Париж. В творчеството му от този период голямо място заемат произведения със сюжети от този род заведения. Сред най-известните е голямото живописно платно "В салона на улица Мулен", завършено през 1895 г. Връща се отново към сюжетите от артистичния свят на Париж. Прави плакати за представленията на певиците Мей Милтън и Мей Белфорт. По молба на бившата звезда на "Мулен Руж" Ла Гулю, рисува декорацията за павилиона ѝ. Предприема пътуване до Лондон, където се запознава с Оскар Уайлд и до Лисабон.
Възмутените от скандалното му поведение, роднини се събират и под ръководството на чичо му Шарл изгарят негови картини намиращи се в Алби. Впоследствие участниците в събитието отричат факта. През 1897 г. Лотрек предприема пътуване до Холандия. Тук се запознава отблизо с творбите на холандските майстори. През месец май 1898 е представена негова изложба в галерия "Гупил" в Лондон. Здравето му все повече се влошава, поради злоупотребата с алкохол. След един пристъп на делириум тременс е настанен в психиатричната болница в Ньой където престоява от февруари до май 1899 г. След излизането си е в Кротоа, Хавр и Тоса. Есента е в Париж и се връща се към предишния си начин на живот и алкохола. Лятото на 1900 г. прекарва в Хавр и Аркашон, есента в Малроме, а зимата в Бордо. Рисува много.
На 20 август 1901 г. получава паралитичен удар. Майка му го отвежда от Париж в Малроме. Тук Тулуз-Лотрек умира на 9 септември, на 38 годишна възраст.